Replicação

Uma característica essencial à continuidade da vida em nosso planeta é a capacidade que os organismos tem de fazerem cópias de si mesmos. Essa capacidade de copiar está associada ao material hereditário, o DNA. Agora, de que maneira os organismos fazem as cópias?


Essas cópias são feitas através da duplicação do material hereditário, ou seja, do DNA. Esse processo de duplicação do DNA, chamamos de replicação.

Em 1953, Watson e Crick propuseram um modelo para o DNA, e também sugeriram um mecanismo para sua replicação. No item História, em Identificação do DNA como material hereditário, podemos ver os experimentos que evidenciaram o processo da replicação semiconservativa do DNA.

A compreensão desse processo vem aumentando e hoje em dia a ciência tem uma boa idéia de como se dá o processo de replicação do DNA.

Descobriu-se que ocorrem erros no processo de replicação e que, se esses erros não forem corrigidos pelas polimerases, eles se perpetuam na forma de mutações. Além disso, o DNA sofre continuamente danos causados por agentes externos físicos e químicos. As células tem um mecanismo sofisticado para reparar esses danos, mas, entretanto, alguns permanecem e se perpetuam também na forma de mutação.

Essa baixa taxa de mutação, é, no entanto, fundamental para a evolução, pois é através dessas falhas que novos alelos se formam.

O processo de replicação do DNA envolve a participação de diversas enzimas, entre elas, as polimerases. Elas atuam no processo da síntese da nova molécula de DNA. Mas, como a síntese ocorre?

A síntese semi-conservativa do DNA precisa que desoxirribonucleotídeos livres, sejam posicionados sobre uma cadeia polinucleotídica molde, e estejam unidos entre si, formando uma nova cadeia complementar à cadeia mãe que serve como molde. A enzima que atua nesse processo é a polimerase.

Como as polimerases foram identificadas e classificadas?

Em 1957, a primeira enzima capaz de polimerizar desoxirribonucleotídeos trifosfatados (dNTPs) à medida em que eles se ordenam sobre a cadeia polinucleotídica (molécula molde), foi extraída da bactéria Escherichia coli.

Mais tarde descobriu-se mais duas enzimas também capazes de catalisar a síntese do DNA. Elas foram denominadas polimerases do DNA e identificadas por números romanos de acordo com a ordem de sua descoberta.

As polimerases e outras enzimas foram identificadas e caracterizadas em mutantes bacterianos deficientes em replicação.

Sabemos o que as polimerases fazem e como elas foram identicadas, mas de que maneira elas trabalham? De que modo elas catalisam a síntese do DNA?

A reação de polimerização de cadeias polidesoxirribonucleotídicas

As polimerases do DNA atuam adicionando um nucleotídeo por vez na extremidade 3´-OH livre de uma cadeia polinucleotídica em formação, que se encontre emparelhada com a cadeia molde. Por isso dizemos que a síntese de DNA ocorre no sentido 5´-> 3´.

O primeiro passo na adição de um novo nucleotídeo à nova cadeia que está sendo sintetizada, é o emparelhamento deste ao nucleotídeo correspondente na cadeia molde. A identificação do dNTP (desorribonuleotídeo trifosfatado) a ser incorporado é feita através de um emparelhamento de bases entre o dNTP e o nucleotídeo da cadeia molde. Como se dá esse emparelhamento?

dT emparelha-se com dA
dG emparelha-se com dC
d – desoxirribonucleotídeo
T – timina A – adenina G – guanina C – citosina

Estando o dNTP emparelhado corretamente, a polimerase do DNA catalisa a formação de uma ligação fosfodiester 5′ – 3′ entre o novo nucleotídeo e a cadeia em formação. A ligação fosfodiéster ocorre como consequência de um ataque nucleofílico do grupo 3′-OH livre da cadeia em formação sobre o fosfato do dNTP que está sendo incorporado. A hidrólise do trifosfato do nucleotídeo fornece a energia termodinâmica para a polimerização. Após a formação da ligação fosfodiéster, a polimerase do DNA avança um resíduo de nucleotídeo na cadeia molde posicionando-se para promover a ligação de um novo dNTP à cadeia em crescimento.

Clicando no link a seguir você poderá ver uma animação mostrando a incorporação de um novo nucleotídeo à cadeia em formação.

Atividade autocorretora das polimerases do DNA

As polimerases do DNA só adicionam um nucleotídeo à cadeia em crescimento se o último estiver corretamente emparelhado ao nucleotídeo correspondente da cadeia molde. Caso isso não ocorra, as polimerases do DNA removem o nucleotídeo da extremidade 3´OH livre incorretamente emparelhado. Essa propriedade das polimerases é denominada atividade exonucleotídica 3´ => 5´. Note que ela é inversa ao sentido de crescimento da cadeia.

A atividade exonucleotídica 3´=> 5´ das polimerases do DNA é um mecanismo autocorretor que permite a elas conferir o último nucleotídeo incorporado, corrigindo seus próprios erros de incorporação à medida que se movem ao longo do DNA molde.

O que garante às polimerases essa atividade corretora é a necessidade de um nucleotídeo corretamente emparelhado à cadeia molde para a adição do próximo. Esse processo de autocorreção é importante, uma vez que a taxa de incorporação de nucleotídeos errados é alta, da ordem de 1 a cada 10.000 nucleotídeos incorporados. Com a atividade autocorretora, essa taxa de erros cai para 1 a cada 10.000.000. Essa é uma das menores taxas de erros conhecida para enzimas.

A atividade autocorretora das polimerazes é essencial para garantir a alta fidelidade de replicação do DNA e, portanto, a estabilidade genética no decorrer das gerações, pois um erro de incorporação não corrigido, produz uma mutação. Assim, não fosse o sistema autocorretor das polimerases, a taxa de mutação seria muito maior devido à alta frequência com que nucleotídeos errados são incorporados.

Agora, por que a frequência de incorporação errada é tão alta?

A incorporação de nucleotídeos errados se deve ao fato de as complementaridades padrão entre as bases nitrogenadas (A com T e C com G) não serem as únicas possíveis. Com pequenas distorções na hélice do DNA podem ocorrer outros tipos de emparelhamentos, como entre G e T. Outra fonte de erros de incorporação é a ocorrência transitória de formas tautoméricas de bases, que acontece na frequência de 1 pra 10.000 ou 100.000 bases. Tautômero é um tipo de isômero resultante do deslocamento transitório das ligações químicas em uma molécula.

Na figura a seguir podemos ver a tautomerização das bases do DNA (adenina, citosina, guanina e timina).

No esquema acima podemos ver a Adenina e a Citosina variando entre as formas tautoméricas, amino e imino.
No esquema acima podemos ver a Guanina e a Timina variando entre as formas tautoméricas, ceto e enol.

O equilíbrio dessas reações é bastante deslocado na direção das formas amino e ceto.

Na forma tautomérica, a base passa a fazer outros tipos de pontes de hidrogênio, emparelhando-se com bases diferentes de suas parceiras usuais. Por exemplo, a forma imino da adenina emparelha com a citosina e a forma enol da timina emparelha-se com a guanina. Podemos ter então, os eguinte emparelhamento:

A (amino) emparelha-se com C
T
(enol)
emparelha-se com G

Dessa forma, quando a base de um nucleotídeo assume espontaneamente sua forma tautomérica, ocorre um erro de incorporação. No entanto, ao voltar a seu estado normal, o que ocorre rapidamente, a base não consegue manter aquele tipo de emparelhamento e, aí sim, a hélice do DNA se distorce.

As polimerases do DNA só conseguem catalisar o crescimento de uma cadeia polinucleotídica no sentido 5´=> 3´, isto é, elas só conseguem adicionar nucleotídeos na extremidade 3´-OH livre de uma cadeia em crescimento. Isso garante que a energia necessária para a incorporação de um novo nucleotídeo seja fornecida por ele mesmo e não pela extremidade da cadeia em crescimento. Lembre-se que a energia é fornecida pela quebra das ligações entre os fosfatos ligados ao carbono 5´ do trifosfato de nucleotídeo a ser incorporado. Caso existisse uma polimerase capaz de catalisar a sínteze no sentido 3´=> 5´, a energia necessária para a incorporação de um novo nucleotídeo teria que ser fornecida, obrigatoriamente, pela extremidade da cadeia em crescimento. Dessa forma, o último nucleotídeo incorporado a uma cadeia em formação, não poderia ser eliminado da cadeia, pois não haveria mais energia para incorporação de novos nucleotídeos. Assim, não seria possível que a polimerase corrigisse seus próprios erros de incorporação e a taxa de mutação seria altíssima, incompatível com um sistema vivo complexo. Portanto, a necessidade de uma replicação com alta fidelidade, provavelmente explica o porquê da replicação ocorrer somente no sentido 5´ => 3´.

Os tipos de polimerases do DNA da bactéria E. coli

As três polimerases do DNA das bactérias diferem quanto a sua função fisiológica. A polimerase III é a responsável pelo crescimento das novas cadeias polinucleotídicas durante a replicação do DNA. A polimerase I é uma enzima de reparo, isto é, ela corrige lesões na molécula de DNA. O papel da polimerase IIin vivo não é conhecido ainda.

A replicação do DNA

Até aqui estudamos como a polimerase atua no processo de replicação do DNA e como um novo nucleotídeo é incorporado à cadeia em formação. Vimos também que a replicação ocorre no sentido 5´ => 3´ e entendemos o porquê de ocorrer nesse sentido, visto o alto indíce de mutação que poderia ocorrer caso fosse no sentido contrário.

Agora vamos estudar mais detalahadamente todo o processo de replicação do DNA, a começar a pelo sentido da síntese de DNA.

Entendo o sentido da síntese do DNA e de que forma as cadeias são sintetizadas (semidescontínua), vamos entender como a síntese do DNA é inicializada em “O RNA iniciador da síntese de DNA