Evidência da replicação semiconservativa


Já tínha-se as evidências de que o DNA era a molécula que continha as informações hereditárias e, já tínha-se um modelo para sua estrutura. Faltava uma proposta para como essa molécula se replicava, isto é, se reproduzia. Uma hipótese para a replicação da molécula de DNA foi proposta por Watson e Crick em 1953, em seguida à proposta do modelo de sua estrutura. Watson e Crick imaginaram que durante a replicação do DNA, cada uma das duas cadeias da molécula serviria como um molde para a confecção de uma nova cadeia complementar. Dessa forma, uma molécula de DNA, ao se replicar, produziria duas moléculas filhas, idênticas à molécula mãe original, cada uma delas contendo uma das cadeias da molécula mãe antiga, e uma nova cadeia, recém-sintetizada. De acordo com essa hipótese, metade da molécula de DNA é conservada a cada replicação, portanto, esse mecanismo de reprodução do DNA foi chamado de replicação semiconservativa.

Figura 1 - Representação esquemática da replicação semiconservativa. Fonte:

cores sólidas – DNA original que consiste de duas hélices complementares, antiparalelas que se abrem através da quebra das pontes de hidrogênio.

cores sem preenchimento – Nova hélice complementar antiparalela que é sintetizada a partir da molécula original que atua como molde.

O teste da hipótese da replicação semiconservativa

Tendo a hiopótese da replicação semiconservativa, o próximo passo era testar essa hipótese. Esse teste foi possível graças ao desenvolvimento das técnicas de análise bioquímica que ocorreu ao longo da década de 1950.
Esse teste foi feito pela primeira vez em 1958 pelos pesquisadores Matthew Meselson1 (n. 1930) e Franklin Stahl1 (n. 1929). Eles trabalharam com a marcação do DNA por incorporaçao de nitrogênio pesado 15N.

Meselson e Stahl imaginaram que, se as duas cadeias polinucleotídicas de uma molécula de DNA fosse marcadas, seria possível fazer uma previsão sobre o destino dessas cadeias no decorrer das gerações celulares subsequentes.

Segundo a previsão:

a) após uma replicação, ambas as moléculas filhas estariam marcadas e cada uma delas conteria metade da marcação da molecula mãe original.
b) após duas replicações, metade das moléculas estaria marcada e, a outra metade não. A metade marcada, conteria a mesma marcação que as moléculas originais (que foram geradas na primeira replicação).

O teste da hipótese semiconservativa foi possível porque na época os autores dispunham de métodos eficientes para marcar as moléculas de DNA assim como para separar as moléculas marcadas das não-marcadas, e entre as marcadas, distinguir as moléculas com diferentes quantidades de marcação.

Meselson e Stahl marcaram as moléculas parentais de DNA com um isótopo pesado, mas não radioativo, do nitrogênio, o 15N. Eles fizeram isso cultivando Escherichia coli em um meio de cultura no qual a única fonte de nitrogênio disponível era um sal contendo o isótopo 15N. Após 14 gerações nesse meio de cultura, pôde-se prever que todo o DNA das bactérias continha 15N ao invés de 14N. As bactérias foram, então, transferidas para um meio de cultura contendo apenas a forma leve do nitrogênio, o 14N. Assim, todo o DNA sintetizado a partir desse momento, seria sintetizado com o 14N, e não mais com 15N.

De acordo com a hipótese da replicação semiconservativa era previsto que, após um ciclo de replicação no novo meio de cultura (contendo apenas 14N), cada nova molácula de DNA conteria 50% de 15N e 50% de 14N; e, após dois ciclos de replicação, metade das moléculas de DNA conteria apenas 14N enquanto que a outra metade seria 50% 15N e 50% 14N, conforme podemos ver no esquema mostrado na figura a seguir.

,strong>Figura 2 - Resultados previstos caso a replicação do DNA fosse semiconservativa. Modificada a partir de http://ntri.tamuk.edu/cell/semiconservative.gif

vermelho = 15N                                                                                                                    azul = 14N

Agora, de que maneira foi possível identificar os diferentes tipos de molécula (contendo diferentes quantidade de 14N e 15N ) para verificar se a previsão se confirmava?

A distinção entre os diferentes tipos de DNA foi possível graças a técnica analítica desenvolvida por Jerome Vinograd2, que ficou conhecida como centrifugação de equilíbrio em gradiente de densidade. O gradiente de densidade se forma quando uma solução de cloreto de césio é submetida a uma ultracentrifugação. O sal de césio fica distribuído em concentrações gradativamente maiores, do topo para o fundo do tubo de ensaio, de modo que a solução é mais densa no fundo e menos densa no topo. Quando moléculas são misturadas a uma solução de cloreto de césio, e essa mistura é submetida a uma ultracentrifugação, as moléculas se posicionarão no gradiente de densidade do césio, em uma faixa correspondente à sua própria densidade.

Moléculas de DNA com diferentes proporções de 14N e 15N tem densidades diferentes e, portanto, se posicionarão em regiões diferentes no tubo de ensaio de acordo com a proporção que possuírem desse elemento. O 15N é mais denso que o 14N, portanto teremos as moléculas de DNA distribuídas da seguinte maneira no tubo:


100% 15N: mais abaixo (vermelho).
100% 14N: mais acima (azul).
50% 15N, 50% de 14N: posição intermediária (azul/vermelho).

Em seu experimento, Meselson e Stahl verificaram, que:

1 – moléculas de DNA extraídas de bactérias cultivadas em meio normal com 14N formavam uma faixa na parte superior do gradiente de cloreto de césio, ou seja, tinham uma densidade relativamente baixa.
2 – O DNA extraído de bactérias cultivadas por 14 gerações em 15N, formava uma faixa na parte inferior do gradiente, isto é, tinha uma densidade relativamente alta.
3 – O DNA extraído da primeira geração produzida a partir de bacterias marcadas com 15N e cultivadas em 14N, ficavam numa posição intermediária do gradiente, entre as duas anterioes.
4 – O DNA extraído da segunda geração produzida a partir de bacterias marcadas com 15N e cultivadas em 14N, formavam duas faixas no gradiente de césio, uma correspondente as moléculas não-marcadas (14N) e outra correspondente às moléculas contendo 50% 14N e 50% 15N.

Figura 3 - Resultados do experimento de Meselson e Stahl. Modificada a partir de http://ntri.tamuk.edu/cell/semiconservative.gif

(1) DNA da E. coli todo marcado com 15N após 14 gerações. DNA com alta densidade no fundo do tubo de ensaio.
(2) Primeiro ciclo de replicação. Temos todas as moléculas filhas marcadas (50% 15N, 50% 14N). DNA com densidade média em posição intermediária no tubo de ensaio.
(3) Temos metade das moléculas não-marcadas (apenas 14N) e metade marcada (50% 15N, 50% 14N). As moléculas de DNA ocupam duas faixas no tubo de ensaio, uma de densidade mais leve (posição mais alta) e outra de densidade média (posição intermediária)
(4) Temos 75% das moléculas não-marcadas e 25% das moléculas marcadas (50% 15N, 50% 14N). As moléculas de DNA ocupam duas faixas no tubo de ensaio, uma, em maior quantidade, de densidade mais leve (posição mais alta) e outra de densidade média (posição intermediária).

Os resultados experimentais concordaram, portanto, com a previsão da hipótese da replicação semiconservativa do DNA, a qual foi, então, aceita como verdadeira.
Podemos ver na figura a seguir o modelo da replicação conservativa e o da semiconservativa e as fotografias da absorção da luz UV obtidas, mostrando as bandas de DNA no gradiente de cloreto de césio, comprovando a teoria da replicação semiconservativa.

Figura 4 -Resultados do experimento de Meselson e Stahl. Modificada a partir de: http://www-biology.ucsd.edu/classes/bimm100.WI00/images/10-1.gif

P – Pesado                                          L – Leve

Tem-se na promeira coluna a proposta de um modelo conservativo, na segunda coluna a proposta do modelo semiconservativo e, na terceira coluna, as fotografias de absorção de luz UV, obtidas por Meselson e Stahl, mostrando as bandas de DNA no gradiente de césio, confirmando a proposta da replicação semiconservativa.


1 – Para saber mais sobre Matthew Meselson e Franklin Stahl:

http://www.mendel-museum.org/images/3news/commun/Meselson-Stahl.jpg

Biografia de Meselson e Stahl


2 – Para saber mais sobre Jerome Vinograd:


Arquivo no formato PDF contendo a biografia de Jerome Vinograd. Clique no ícone abaixo para fazer o download ou visualizar o arquivo:
Arquivo: 1,1 MB
Retirado de: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=343747

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