Replicação do cromossomo bacteriano


Os experimentos realizados por Meselson e Stahl haviam evidenciado que a replicação do DNA era semiconservativa. No entanto, seus resultados não haviam provido nenhuma informação sobre como era a replicação do cromossomo. Questões como “em quantos lugares a replicação é iniciada” (origens da replicação), e “qual seria a direção da replicação”, ainda precisavam ser respondidas.

No início da década de 1960, John Cairns conseguiu pela primeira vez, observar DNA bacteriano em duplicação. Ele confirmou a forma circular sugerida pelos experimentos genéticos anteriormente realizados, e consegui observar como a replicação do DNA bacteriano ocorria.

A técnica usada por Cairns permitiu a observação das moléculas íntegras de DNA bacteriano. Isso foi um grande feito, pois essas moléculas se quebram facilmente durante o processo de isolamento.

Sobre isso, Cairns escreveu o seguinte:

“Embora nada se soubesse a respeito do número de moléculas do DNA no cromossomo da Escherichia coli, sabia-se que a dispersão do DNA da bactéria entre os seus descendentes, era semi-conservativa. Por esta e outras razões, parecia provável que o cromossomo bacteriano fosse uma única molécula de DNA muito grande. No entanto, todo o DNA isolado de bactérias, era constituído por moléculas muito menores que o tamanho esperado para o cromossomo completo. Uma explicação para isso foi sugerida por A.D. Hershey […]. Ele afirma que moléculas de DNA gigantes, como as que formam o cromossomo de certos vírus [..] são tão grandes que se tornam excessivamente frágeis. Talvez o mesmo seja verdade a respeito do cromossomo bacteriano […] que contém cerca de 20 vezes mais DNA que o maior vírus bacteriano.”

Cairns concluiu que o procedimento para visualizar a replicação do DNA bacteriano deveria ser delicado o suficiente para evitar que a molécula se quebrasse. Além disso, os contornos da fibra original e da recém-sintetizada, deveriam ser observados.

O aparelho ideal para observar fibras tão finas, como era a molécula de DNA, seria o microscópio eletrônico. No entanto, Cairns optou pela auto-radiografia e observação no microcópio óptico.

A técnica de auto-radiografia consiste em se marcar com isótopos radioativos as moléculas que se deseja observar. Em seguida, o material marcado é coberto com uma emulsão fotográfica e mantido protegido da luz por um certo tempo que pode variar, de horas a meses, dependendo do grau de marcação. Nesse período de exposição, a radiação beta (elétrons resultantes da desintegração atômica do núcleo do isótopo) impressiona a emulsão fotográfica. Assim, após a revelação da emulsão, os grãos negros no filme corresponderão a desintegrações atômicas, revelando a presença de isótopos radioativos no local impressionado.

Cairns usou timina radioativa para marcar as moléculas de DNA bacteriano. Ele adicionou essa substância ao meio de cultura das bactérias, imaginando que ela seria absorvida pelas células e, no caso delas estarem duplicando o seu cromossomo, ela seria incorporada às novas moléculas de DNA. Como a timina é um componente exclusivo do DNA, é um marcador específico de DNA.

Essa técnica já havia sido utilizada por Cairns para marcar DNA viral e mostrar a forma de seu cromossomo.

Porque a escolha da auto-radiografia e microscopia óptica?

Segundo Cairns, “esta oferece certas vantagens peculiares e porque já provou ser a técnica mais fácil, embora menos precisa, para a visualização das moléculas grandes de DNA. Além disso, apesar do baixo poder de resolução da auto-radiografia (comparada ao microscópio eletrônico), as moléculas de DNA são tão longas que aparecem sob a forma de um arranjo linear de grãos (resultantes da impressão do filme autorradiográfico). O método exagera grosseiramente o diâmetro do DNA, mas isso não constitui problema para o estudo que realizo

Cairns descreve seu trabalho com as bactérias da seguinte maneira:

“O projeto geral dos experimentos requeria que o DNA marcado fosse extraído das bactérias tão delicadamente quanto possível, e depois montado – sem quebrar suas moléculas – para a auto-radiografia. O que fiz foi matar as bactérias que tinham sido alimentadas com timina radioativa por diversos períodos de tempo, colocando-as em um pequeno recipiente, fechado em um dos lados por uma membrana semipermeável. No recipiente foi adicionada uma solução contendo a enzima lisozima e um detergente para romper as células bacterianas e liberar seu DNA”

Após a digestão da bactérias, a membrana que cobria o recipiente era perfurada e o líquido era escorrido vagarosamente. Nesse processo, algumas moléculas de DNA ficavam aderidas ao filtro que era, então, coberto com uma emulsão fotográfica e deixado em exposição por cerca de dois meses. Cairns optou por deixar que o DNA aderisse espontaneamente ao filtro para diminuir a turbulência sofrida pelas moléculas, evitando sua quebra. Visto que a E. coli sintetiza DNA durante todo seu ciclo de divisão, algum DNA extraído, deveria ser flagrado no ato de replicação.

FIGURA ESQUEMATICA DO EXPERIMENTO DE CAIRNS:

1 - As bactérias e a lisozima são colocadas em um recipiente fechado por uma membrana semipermeável.

2- O recipiente é mergulhado em uma solução contendo detergente, o qual difunde-se através da membrana semi-permeável e provoca ruptura das células bacterianas com liberação de seu DNA.

3 - O recipiente é transferido para uma solução salina cujo objetivo é eliminar o detergente por difusão.

4 - A membrana semi-permeável é perfurada de modo que a solução do recipiente escoe lentamente.

5 - À medida que a solução escoa, moléculas de DNA ficam aderidas à membrana semi-permeável.

6 - A membrana é retirada, colocada sobre uma lâmina de microscopia e coberta com emulsão fotográfica.

Figuras criadas a partir do desenho encontrado na apostila do curso de Biologia Molecular da graduação em Ciências Biológicas – USP.

Segundo Cairns:

“Uma virtude peculiar da autoradiografia é que se vê apenas aquilo que foi marcado. Dessa forma, a técnica pode dar informações sobre a história e a forma de uma estrutura marcada. A maneira mais fácil de determinar qual dos esquemas de replicação estava ocorrendo seria observar um DNA que tivesse replicado por um curto período de tempo na presença de timina marcada. Apenas o DNA sintetizado mais recentemente seria visível e, assim, seria possível determinar se as duas moléculas descendentes, estavam sendo produzidas no mesmo ponto ou em regiões diferentes da molécula original.”

As figuras obtidas após marcação por apenas 3 minutos, cerca de 1/10 do tempo de geração, mostraram que os dois fios marcados estavam sendo produzidos no mesmo local, ou seja, em uma região particular de uma molécula original maior. Elas mostraram também que pelo menos 80 micrômetros de DNA se replica nesse intervalo de tempo.

Outra conclusão foi que duas estruturas estão sendo sintetizadas simultaneamente na região de replicação o que evidencia o aspecto semi conservativo da duplicação cromossômica em bactéria.

No entanto, saber se o cromossomo bacteriano era constituído por uma única molécula de DNA e como se dava a sua duplicação como um todo, demandou um grande esforço.

Cairns descreve essa etapa da investigação nos seguintes termos:

“Foi necessário observar o DNA marcado com timina através de várias gerações. Além disso, era preciso encontrar, no emaranhado de cromossomos extraídos de E. coli, auto-radiografias de cromossomos intactos e desembaraçados o suficiente para poderem ser vistos integralmente.

Os resultados de Cairns levaram-no a concluir:

1. “O cromossomo de E. coli contém, aparentemente, uma única molécula de DNA, de mais ou menos 1 milímetro de comprimento […]. É, de longe, a maior molécula de que se tem conhecimento no sistema biológico.”

2. “A molécula contém duas cadeias polinucleotídicas que se separam na época da duplicação.”

3. “A molécula se duplica em um único ponto que se desloca por todo o cromossomo. Nesse ponto, as duas novas cadeias estão sendo produzidas: duas cadeias vão se tornando quatro. Esse ponto veio a se chamar ‘forquilha’ de replicação, por causa de sua forma.”

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