Como já visto nas seções anteriores da Replicação do DNA (Replicação e Sentido da sintese de DNA), a atividade de síntese das polimerases do DNA é adicionar nucleotídeos na extremidade 3´OH livre de uma cadeia em crescimento. Isso quer dizer que as polimerases do DNA requerem a presença de uma extremidade 3´OH livre de um nucleotídeo corretamente emparelhado à cadeia molde, para poderem atuar.

Assim, as polimerases do DNA não conseguem iniciar uma síntese, ou seja, adicionar um primeiro nucleotídeo sobre uma cadeia molde. Mas, então, como a síntese do DNA é iniciada?

A primase do DNA e a síntese do primer de RNA

Para que a polimerase III do DNA comece uma polimerização é necessário que uma outra enzima adicione os primeiros nucleotídeos. Essa enzima é uma polimeraze especial que catalisa a síntese de um pequeno fragmento de RNA sobre a cadeia molde do DNA, o qual atua como inciador para a polimerase III do DNA adicionar desoxirribonucleotídeos.

O fragmento de RNA iniciador de uma cadeia de DNA que, em bactéria, tem cerca de 2 a 3 nucleotídeos, é chamado de primer de RNA e a enzima que catalisa sua síntese é denominada primase do DNA.

A primase do DNA atua no início da replicação, sintetizando o primer necessário para começar a síntese da cadeia leading, e também, durante todo o processo, sintetizando os primers necessários para o início da síntese de cada fragmento de Okazaki. Isso é necessário porque após completar um fregmento de Okazaki, a polimerase do DNA da cadeia lagging precisa iniciar a síntese de um novo fragmento.

Os primers de RNA são feitos a intervalos regulares sobre a cadeia molde da cadeia lagging e são, em seguida, alongados pela polimerase III para gerar os fragmentos de Okazaki. A síntese de cada fragmento de Okazaki termina quando a polimerase do DNA atinge o primer de RNA ligado à extremidade 5´ do fragmnento sintetizado anteriormente.

Clicando no link a seguir, você poderá ver uma animação ilustrando o processo da replicação do DNA, mostrando a ação da primase e da polimerase III, sintetizando a cadeia leading e os fragmentos de Okazaki na cadeia lagging.

A substituiçaõ do primer por um segmento de DNA

Nas proximidades da forquilha de replicação, a cadeia lagging é constituída, portanto, por fragmentos de Okazaki, ligados à seus respectivos primers de RNA, dispostos linearmente ao longo da cadeia molde. Os primers de RNA precisam ser removidos e substituídos por segmentos de DNA, antes dos fragmentos de Okazaki serem unidos entre si. A eliminação dos primers é feita pela atividade exonucleotídica 5´ => 3´ de uma enzima que pode ser tanto uma “Rnase H” quanto a “polimerase I” do DNA.

A Rnase é uma enzima que degrada especificamente moléculas de RNA que formam híbridos com DNA, ou seja, cadeias de RNA emparelhadas a cadeias de DNA. Assim, elas podem detectar o primer de RNA, que se encontra emparelhado à cadeia molde de DNA, e degradá-lo. Quando isso ocorre, cria-se uma falha entre dois fragmentos de Okazaki contiguos, a qual é preenchida por ação de uma polimerase de reparo de DNA, a polimerase I do DNA.

Características da polimerase I do DNA

A polimerase I do DNA é uma cadeia polipeptídica única com três atividades enzimáticas:

1 – polimerização no sentido 5´ => 3´
2 – atividade exonucleotídica no sentido 3´ => 5´
3 – atividade exonucleotídica no sentido 5´ => 3´

Existem proteases que cortam a polimerase I em dois fragmentos polipeptídicos de tamanhos diferentes. O maior, denominado fragmento Klenow, conserva a capacidade de polimerização e a atividade exonucleotídica 3´ => 5´. Já o fragmento menor, que não recebe denominação especial, mantém a atividade exonucleotídica 5´ => 3´.

A reação de deslocamento do corte

Graças a sua capacidade de alongamento de cadeia polinucleotídica e à sua atividade exonucleotídica 5´ => 3´, a polimerase I do DNA é capaz de substituir os primers de RNA por segmentos de DNA por meio de um processo denominado deslocamento do corte (do ingês nick translation). Nesse processo, a polimerase I reconhece um corte (nick) na cadeia do DNA, isto é, ausência de ligação fosfodiéster entre a extremidade 3´ de um resíduo de nucleotídeo e a extremidade 5´ do resíduo vizinho, que, nesse caso, é o início do primer de RNA. Uma vez conhecido o nick, a enzima se liga à extremidade 3´OH livre e, por meio de sua atividade exonucleotídica 5´ = 3´, remove por hidrólise o primeiro ribonucleotídeo do primer do fragmento de okazaki seguinte. Enquanto isso ocorre, a atividade polimerizadora da enzima, adiciona, à extremidade 3´OH do fragmento de Okazaki ao qual ela está ligada, um desoxirribonucleotídeo no lugar do ribonucleotídeo que foi removido.

Desse modo, o nick se desloca um nucleotídeo no sentido 5´ => 3´ e o processo se repete. A polimerase I do DNA realiza em sequência cerca de 10 a 12 ciclos de hidrólise e polimerização antes de se dissociar do DNA. Isso é mais do que suficiente para substituir todo o primer de RNA por DNA. Essa reação chama-se nick translation, pelo fato da atividade da enzima mover o nick entre dois fragmentos de Okazaki.

A replicação semi-conservativa do DNA exige que duas cadeias polinucleotídicas que formam a hélice do DNA se separem, de modo a expor as bases que irão orientar o emparelhamento dos nucleotídeos para formação das novas cadeias complementares às cadeias moldes.

A separação de duas cadeias da hélice do DNA ocorre à medida que as novas cadeias vão sendo sintetizadas. A região de separação das cadeias tem a forma de uma letra Y e é denominada forquilha de replicação.

A síntese semidescontínua do DNA

Os experimentos mostraram que ambas as cadeias filhas são sintetizadas na forquilha de replicação por um complexo de enzimas que inclui a polimerase III do DNA. Como, no entanto, as duas cadeias moldes são antiparalelas, em uma delas a síntese da cadeia complementar ocorre no sentido 5´ => 3´, mas na outra cadeia essa síntese teria que se dar no sentido inverso, ou seja, 3´ => 5´. No entanto, as duas cadeias são sintetizadas pela polimerase III do DNA, que só catalisa o crescimento da cadeia no sentido 5´ => 3´.

A explicação para esse paradoxo é que, na forquilha de replicação, uma das cadeias é sintetizada continuamente por uma polimerase que se move no mesmo sentido do deslocamento da forquilha. Já a cadeia com polaridade inversa é sintetizada no sentido inverso ao do deslocamento da forquilha de replicação, portanto, também no sentido 5´ => 3´. Isso é possível porque, nesse último caso, a polimeraze sintetiza segmentos polinucleotídicos curtos, que são, posteriormente, unidos para formar a nova cadeia contínua.

Na figura abaixo podemos ver as duas cadeias sendo sintetizadas no sentido 5´ => 3´.

Figura 1 -Replicação do DNA. Ambas as cadeias são sintetizadas no sentido 5´ => 3´. A cadeia leading é sintetizada continuamente, enquanto a cadeia lagging é sintetizada descontinuamente. Modificada a partir de http://www.blc.arizona.edu/Marty/181/181Lectures/Figures/POHS_Figures/Chap11/Fig11_16.gif

A cadeia que cresce no mesmo sentido que o deslocamento da forquilha de replicação, e cuja síntese ocorre continuamente, é chamada de cadeia leading, conforme pode ser visto na figura 1 acima.

A cadeia que cresce no sentido oposto ao deslocamento da forquilha de replicação, e cuja síntese ocorre descontinuamente, é chamada de cadeia lagging.

Esse modo de replicação do DNA, em que uma das cadeias é sintetizada continuamente e a outra, descontinuamente, é chamado de síntese semidescontínua. Costuma-se dizer também qua a síntese do DNA na forquilha de replicação é assimétrica, pois em uma das cadeias (cadeia leading) ela ocorre continuamente, enquanto que na outra (cadeia lagging) ela ocorre de modo descontínuo, em fragmentos. Esses fragmentos são denominados fragmentos de Okazaki e podem ser vistos na figura 1 acima.

A descoberta dos fragmentos de Okazaki

A hipótese da síntese descontínua da cadeia lagging foi corroborada por um experimento realizado pelo pesquisador Reiji Okazaki¹, no final da década de 1960. Okazaki forneceu, a bacterias em divisão, timina tritiada, isto é, um desoxirribonucleotídeo com a base timina (=timidina) marcado com átomos de trítio (um isótopo radioativo do hidrogênio).

Esse precursor do DNA, altamente radioativo, foi deixado em contato com as bactérias por apenas alguns segundos, de modo que somente o DNA recém-sintetizado, ou seja, aquele imediatamente após a forquilha de replicação, se tornasse radioativo. O DNA foi então isolado e analisado, mostrando que parte da radioatividade estava contida em fragmentos de cadeias polinucleotídicas, com cerca de mil a dois mil nucleotídeos.

Quanto maior fosse o tempo de contato das bactérias com o precursor radioativo maior era quantidade de radioatividade em cadeias de DNA de grande tamanho. A conclusão foi que os nucleotídeos eram primeiramente polimerizados em fragmentos de mil a dois mil nucleotídeos, os quais eram, em seguida, reunidos para formar cadeias longas.

Esses pequenos pedaços de DNA que aparecem transitoriamente durante a síntese da cadeia lagging foram denominados fragmentos de Okazaki.

Informações sobre Reiji Okazaki e os experimentos que levaram à descoberta dos fragmentos de Okazaki.

Os experimentos realizados por Meselson e Stahl haviam evidenciado que a replicação do DNA era semiconservativa. No entanto, seus resultados não haviam provido nenhuma informação sobre como era a replicação do cromossomo. Questões como “em quantos lugares a replicação é iniciada” (origens da replicação), e “qual seria a direção da replicação”, ainda precisavam ser respondidas.

No início da década de 1960, John Cairns conseguiu pela primeira vez, observar DNA bacteriano em duplicação. Ele confirmou a forma circular sugerida pelos experimentos genéticos anteriormente realizados, e consegui observar como a replicação do DNA bacteriano ocorria.

A técnica usada por Cairns permitiu a observação das moléculas íntegras de DNA bacteriano. Isso foi um grande feito, pois essas moléculas se quebram facilmente durante o processo de isolamento.

Sobre isso, Cairns escreveu o seguinte:

“Embora nada se soubesse a respeito do número de moléculas do DNA no cromossomo da Escherichia coli, sabia-se que a dispersão do DNA da bactéria entre os seus descendentes, era semi-conservativa. Por esta e outras razões, parecia provável que o cromossomo bacteriano fosse uma única molécula de DNA muito grande. No entanto, todo o DNA isolado de bactérias, era constituído por moléculas muito menores que o tamanho esperado para o cromossomo completo. Uma explicação para isso foi sugerida por A.D. Hershey [...]. Ele afirma que moléculas de DNA gigantes, como as que formam o cromossomo de certos vírus [..] são tão grandes que se tornam excessivamente frágeis. Talvez o mesmo seja verdade a respeito do cromossomo bacteriano [...] que contém cerca de 20 vezes mais DNA que o maior vírus bacteriano.”

Cairns concluiu que o procedimento para visualizar a replicação do DNA bacteriano deveria ser delicado o suficiente para evitar que a molécula se quebrasse. Além disso, os contornos da fibra original e da recém-sintetizada, deveriam ser observados.

O aparelho ideal para observar fibras tão finas, como era a molécula de DNA, seria o microscópio eletrônico. No entanto, Cairns optou pela auto-radiografia e observação no microcópio óptico.

A técnica de auto-radiografia consiste em se marcar com isótopos radioativos as moléculas que se deseja observar. Em seguida, o material marcado é coberto com uma emulsão fotográfica e mantido protegido da luz por um certo tempo que pode variar, de horas a meses, dependendo do grau de marcação. Nesse período de exposição, a radiação beta (elétrons resultantes da desintegração atômica do núcleo do isótopo) impressiona a emulsão fotográfica. Assim, após a revelação da emulsão, os grãos negros no filme corresponderão a desintegrações atômicas, revelando a presença de isótopos radioativos no local impressionado.

Cairns usou timina radioativa para marcar as moléculas de DNA bacteriano. Ele adicionou essa substância ao meio de cultura das bactérias, imaginando que ela seria absorvida pelas células e, no caso delas estarem duplicando o seu cromossomo, ela seria incorporada às novas moléculas de DNA. Como a timina é um componente exclusivo do DNA, é um marcador específico de DNA.

Essa técnica já havia sido utilizada por Cairns para marcar DNA viral e mostrar a forma de seu cromossomo.

Porque a escolha da auto-radiografia e microscopia óptica?

Segundo Cairns, “esta oferece certas vantagens peculiares e porque já provou ser a técnica mais fácil, embora menos precisa, para a visualização das moléculas grandes de DNA. Além disso, apesar do baixo poder de resolução da auto-radiografia (comparada ao microscópio eletrônico), as moléculas de DNA são tão longas que aparecem sob a forma de um arranjo linear de grãos (resultantes da impressão do filme autorradiográfico). O método exagera grosseiramente o diâmetro do DNA, mas isso não constitui problema para o estudo que realizo”

Cairns descreve seu trabalho com as bactérias da seguinte maneira:

“O projeto geral dos experimentos requeria que o DNA marcado fosse extraído das bactérias tão delicadamente quanto possível, e depois montado – sem quebrar suas moléculas – para a auto-radiografia. O que fiz foi matar as bactérias que tinham sido alimentadas com timina radioativa por diversos períodos de tempo, colocando-as em um pequeno recipiente, fechado em um dos lados por uma membrana semipermeável. No recipiente foi adicionada uma solução contendo a enzima lisozima e um detergente para romper as células bacterianas e liberar seu DNA”

Após a digestão da bactérias, a membrana que cobria o recipiente era perfurada e o líquido era escorrido vagarosamente. Nesse processo, algumas moléculas de DNA ficavam aderidas ao filtro que era, então, coberto com uma emulsão fotográfica e deixado em exposição por cerca de dois meses. Cairns optou por deixar que o DNA aderisse espontaneamente ao filtro para diminuir a turbulência sofrida pelas moléculas, evitando sua quebra. Visto que a E. coli sintetiza DNA durante todo seu ciclo de divisão, algum DNA extraído, deveria ser flagrado no ato de replicação.

FIGURA ESQUEMATICA DO EXPERIMENTO DE CAIRNS:

1 - As bactérias e a lisozima são colocadas em um recipiente fechado por uma membrana semipermeável.

2- O recipiente é mergulhado em uma solução contendo detergente, o qual difunde-se através da membrana semi-permeável e provoca ruptura das células bacterianas com liberação de seu DNA.

3 - O recipiente é transferido para uma solução salina cujo objetivo é eliminar o detergente por difusão.

4 - A membrana semi-permeável é perfurada de modo que a solução do recipiente escoe lentamente.

5 - À medida que a solução escoa, moléculas de DNA ficam aderidas à membrana semi-permeável.

6 - A membrana é retirada, colocada sobre uma lâmina de microscopia e coberta com emulsão fotográfica.

Figuras criadas a partir do desenho encontrado na apostila do curso de Biologia Molecular da graduação em Ciências Biológicas – USP.

Segundo Cairns:

“Uma virtude peculiar da autoradiografia é que se vê apenas aquilo que foi marcado. Dessa forma, a técnica pode dar informações sobre a história e a forma de uma estrutura marcada. A maneira mais fácil de determinar qual dos esquemas de replicação estava ocorrendo seria observar um DNA que tivesse replicado por um curto período de tempo na presença de timina marcada. Apenas o DNA sintetizado mais recentemente seria visível e, assim, seria possível determinar se as duas moléculas descendentes, estavam sendo produzidas no mesmo ponto ou em regiões diferentes da molécula original.”

As figuras obtidas após marcação por apenas 3 minutos, cerca de 1/10 do tempo de geração, mostraram que os dois fios marcados estavam sendo produzidos no mesmo local, ou seja, em uma região particular de uma molécula original maior. Elas mostraram também que pelo menos 80 micrômetros de DNA se replica nesse intervalo de tempo.

Outra conclusão foi que duas estruturas estão sendo sintetizadas simultaneamente na região de replicação o que evidencia o aspecto semi conservativo da duplicação cromossômica em bactéria.

No entanto, saber se o cromossomo bacteriano era constituído por uma única molécula de DNA e como se dava a sua duplicação como um todo, demandou um grande esforço.

Cairns descreve essa etapa da investigação nos seguintes termos:

“Foi necessário observar o DNA marcado com timina através de várias gerações. Além disso, era preciso encontrar, no emaranhado de cromossomos extraídos de E. coli, auto-radiografias de cromossomos intactos e desembaraçados o suficiente para poderem ser vistos integralmente.

Os resultados de Cairns levaram-no a concluir:

1. “O cromossomo de E. coli contém, aparentemente, uma única molécula de DNA, de mais ou menos 1 milímetro de comprimento [...]. É, de longe, a maior molécula de que se tem conhecimento no sistema biológico.”

2. “A molécula contém duas cadeias polinucleotídicas que se separam na época da duplicação.”

3. “A molécula se duplica em um único ponto que se desloca por todo o cromossomo. Nesse ponto, as duas novas cadeias estão sendo produzidas: duas cadeias vão se tornando quatro. Esse ponto veio a se chamar ‘forquilha’ de replicação, por causa de sua forma.”

Já tínha-se as evidências de que o DNA era a molécula que continha as informações hereditárias e, já tínha-se um modelo para sua estrutura. Faltava uma proposta para como essa molécula se replicava, isto é, se reproduzia. Uma hipótese para a replicação da molécula de DNA foi proposta por Watson e Crick em 1953, em seguida à proposta do modelo de sua estrutura. Watson e Crick imaginaram que durante a replicação do DNA, cada uma das duas cadeias da molécula serviria como um molde para a confecção de uma nova cadeia complementar. Dessa forma, uma molécula de DNA, ao se replicar, produziria duas moléculas filhas, idênticas à molécula mãe original, cada uma delas contendo uma das cadeias da molécula mãe antiga, e uma nova cadeia, recém-sintetizada. De acordo com essa hipótese, metade da molécula de DNA é conservada a cada replicação, portanto, esse mecanismo de reprodução do DNA foi chamado de replicação semiconservativa.

Figura 1 - Representação esquemática da replicação semiconservativa. Fonte:

cores sólidas – DNA original que consiste de duas hélices complementares, antiparalelas que se abrem através da quebra das pontes de hidrogênio.

cores sem preenchimento – Nova hélice complementar antiparalela que é sintetizada a partir da molécula original que atua como molde.

O teste da hipótese da replicação semiconservativa

Tendo a hiopótese da replicação semiconservativa, o próximo passo era testar essa hipótese. Esse teste foi possível graças ao desenvolvimento das técnicas de análise bioquímica que ocorreu ao longo da década de 1950.
Esse teste foi feito pela primeira vez em 1958 pelos pesquisadores Matthew Meselson¹ (n. 1930) e Franklin Stahl¹ (n. 1929). Eles trabalharam com a marcação do DNA por incorporaçao de nitrogênio pesado ¹⁵N.

Meselson e Stahl imaginaram que, se as duas cadeias polinucleotídicas de uma molécula de DNA fosse marcadas, seria possível fazer uma previsão sobre o destino dessas cadeias no decorrer das gerações celulares subsequentes.

Segundo a previsão:

a) após uma replicação, ambas as moléculas filhas estariam marcadas e cada uma delas conteria metade da marcação da molecula mãe original.
b) após duas replicações, metade das moléculas estaria marcada e, a outra metade não. A metade marcada, conteria a mesma marcação que as moléculas originais (que foram geradas na primeira replicação).

O teste da hipótese semiconservativa foi possível porque na época os autores dispunham de métodos eficientes para marcar as moléculas de DNA assim como para separar as moléculas marcadas das não-marcadas, e entre as marcadas, distinguir as moléculas com diferentes quantidades de marcação.

Meselson e Stahl marcaram as moléculas parentais de DNA com um isótopo pesado, mas não radioativo, do nitrogênio, o ¹⁵N. Eles fizeram isso cultivando Escherichia coli em um meio de cultura no qual a única fonte de nitrogênio disponível era um sal contendo o isótopo ¹⁵N. Após 14 gerações nesse meio de cultura, pôde-se prever que todo o DNA das bactérias continha ¹⁵N ao invés de ¹⁴N. As bactérias foram, então, transferidas para um meio de cultura contendo apenas a forma leve do nitrogênio, o ¹⁴N. Assim, todo o DNA sintetizado a partir desse momento, seria sintetizado com o ¹⁴N, e não mais com ¹⁵N.

De acordo com a hipótese da replicação semiconservativa era previsto que, após um ciclo de replicação no novo meio de cultura (contendo apenas ¹⁴N), cada nova molácula de DNA conteria 50% de ¹⁵N e 50% de ¹⁴N; e, após dois ciclos de replicação, metade das moléculas de DNA conteria apenas ¹⁴N enquanto que a outra metade seria 50% ¹⁵N e 50% ¹⁴N, conforme podemos ver no esquema mostrado na figura a seguir.

,strong>Figura 2 - Resultados previstos caso a replicação do DNA fosse semiconservativa. Modificada a partir de http://ntri.tamuk.edu/cell/semiconservative.gif

vermelho = ¹⁵N                                                                                                                    azul = ¹⁴N

Agora, de que maneira foi possível identificar os diferentes tipos de molécula (contendo diferentes quantidade de ¹⁴N e ¹⁵N ) para verificar se a previsão se confirmava?

A distinção entre os diferentes tipos de DNA foi possível graças a técnica analítica desenvolvida por Jerome Vinograd², que ficou conhecida como centrifugação de equilíbrio em gradiente de densidade. O gradiente de densidade se forma quando uma solução de cloreto de césio é submetida a uma ultracentrifugação. O sal de césio fica distribuído em concentrações gradativamente maiores, do topo para o fundo do tubo de ensaio, de modo que a solução é mais densa no fundo e menos densa no topo. Quando moléculas são misturadas a uma solução de cloreto de césio, e essa mistura é submetida a uma ultracentrifugação, as moléculas se posicionarão no gradiente de densidade do césio, em uma faixa correspondente à sua própria densidade.

Moléculas de DNA com diferentes proporções de ¹⁴N e ¹⁵N tem densidades diferentes e, portanto, se posicionarão em regiões diferentes no tubo de ensaio de acordo com a proporção que possuírem desse elemento. O ¹⁵N é mais denso que o ¹⁴N, portanto teremos as moléculas de DNA distribuídas da seguinte maneira no tubo:

100% ¹⁵N: mais abaixo (vermelho).
100% ¹⁴N: mais acima (azul).
50% ¹⁵N, 50% de ¹⁴N: posição intermediária (azul/vermelho).

Em seu experimento, Meselson e Stahl verificaram, que:

1 – moléculas de DNA extraídas de bactérias cultivadas em meio normal com ¹⁴N formavam uma faixa na parte superior do gradiente de cloreto de césio, ou seja, tinham uma densidade relativamente baixa.
2 – O DNA extraído de bactérias cultivadas por 14 gerações em ¹⁵N, formava uma faixa na parte inferior do gradiente, isto é, tinha uma densidade relativamente alta.
3 – O DNA extraído da primeira geração produzida a partir de bacterias marcadas com ¹⁵N e cultivadas em ¹⁴N, ficavam numa posição intermediária do gradiente, entre as duas anterioes.
4 – O DNA extraído da segunda geração produzida a partir de bacterias marcadas com ¹⁵N e cultivadas em ¹⁴N, formavam duas faixas no gradiente de césio, uma correspondente as moléculas não-marcadas (¹⁴N) e outra correspondente às moléculas contendo 50% ¹⁴N e 50% ¹⁵N.

Figura 3 - Resultados do experimento de Meselson e Stahl. Modificada a partir de http://ntri.tamuk.edu/cell/semiconservative.gif

(1) DNA da E. coli todo marcado com ¹⁵N após 14 gerações. DNA com alta densidade no fundo do tubo de ensaio.
(2) Primeiro ciclo de replicação. Temos todas as moléculas filhas marcadas (50% ¹⁵N, 50% ¹⁴N). DNA com densidade média em posição intermediária no tubo de ensaio.
(3) Temos metade das moléculas não-marcadas (apenas ¹⁴N) e metade marcada (50% ¹⁵N, 50% ¹⁴N). As moléculas de DNA ocupam duas faixas no tubo de ensaio, uma de densidade mais leve (posição mais alta) e outra de densidade média (posição intermediária)
(4) Temos 75% das moléculas não-marcadas e 25% das moléculas marcadas (50% ¹⁵N, 50% ¹⁴N). As moléculas de DNA ocupam duas faixas no tubo de ensaio, uma, em maior quantidade, de densidade mais leve (posição mais alta) e outra de densidade média (posição intermediária).

Os resultados experimentais concordaram, portanto, com a previsão da hipótese da replicação semiconservativa do DNA, a qual foi, então, aceita como verdadeira.
Podemos ver na figura a seguir o modelo da replicação conservativa e o da semiconservativa e as fotografias da absorção da luz UV obtidas, mostrando as bandas de DNA no gradiente de cloreto de césio, comprovando a teoria da replicação semiconservativa.

Figura 4 -Resultados do experimento de Meselson e Stahl. Modificada a partir de: http://www-biology.ucsd.edu/classes/bimm100.WI00/images/10-1.gif

P – Pesado                                          L – Leve

Tem-se na promeira coluna a proposta de um modelo conservativo, na segunda coluna a proposta do modelo semiconservativo e, na terceira coluna, as fotografias de absorção de luz UV, obtidas por Meselson e Stahl, mostrando as bandas de DNA no gradiente de césio, confirmando a proposta da replicação semiconservativa.

http://www.mendel-museum.org/images/3news/commun/Meselson-Stahl.jpg

Biografia de Meselson e Stahl

Arquivo no formato PDF contendo a biografia de Jerome Vinograd. Clique no ícone abaixo para fazer o download ou visualizar o arquivo:
Arquivo: 1,1 MB
Retirado de: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=343747

A descoberta de que o DNA era realmente o material hereditário fez com que diversos pesquisadores voltassem sua atenção para a elucidação da estrutura dessa molécula. A pergunta que se fazia na época era:

Que características permitiam ao DNA ser o banco de memória da informação hereditária ?

O grande desenvolvimento das técnicas biofísicas e bioquímicas que havia ocorrido no período pós-Segunda Guerra Mundial, permitiu que, em menos de 10 anos, a estrutura físico-química do DNA fosse elucidada.

A descoberta de Chargaff

No período de 1949 a 1953, estudos realizados no laboratório de Erwin Chargaff¹ (1905-2002), deram uma contribuição importante para a elucidação da estrutura do DNA.

Chargaff e colaboradores buscaram quantificar cada um dos tipos de base nirogenada do DNA (adenina, timina, citosina e guanina) de várias espécies. Para isso utilizaram métodos de cromatografia.

Podemos ver na tabela a seguir alguns dos resultados obtidos:

Tabela I: Proporções molares de bases em DNA de diversas espécies

Os resultados que Chargaff e sua equipe conseguiram, levaram a importantes conclusões sobre a composição de bases nitrogenadas do DNA. Foi verificado que:

1 – Essa composição variava de uma espécie pra outra, mas que era constante dentro da mesma espécie.
2 – Em qualquer DNA, de qualquer espécie, a porcentagem da base timina era sempre igual a da base adenina, e a porcentagem da base citosina era igual a da base guanina.

Ou seja, enquanto a proporção entre as bases varia entre as espécies, o total de base púricas (A + G) é igual ao total de bases pirimídicas (T + C):

Análises por difração de raios X

Enquanto alguns grupos se dedicavam à análise química do DNA, ou tros estudavam a estrutura da molécula por meio da difração de raios-X, uma metodologia que vinha sendo usada e que estava dando formidáveis conclusões sobre a estrutura das proteínas.

Os resultados mais importantes de difração de raios-x sobre a molécula de DNA foram obtidos por Maurice Wilkins² (n. 1916) e Rosalind Franklin³ (1920 – 1958). Os resultados obtidos indicavam que o DNA tinha uma estrutura helicoidal.

Mas, de que maneira as fotografias obtidas por difração de raios-x indicavam essa estrutura helicoidal do DNA? A seguir podemos ver uma imagem obtida pela difração de raios-x. Ao clicar na imagem abaixo, podemos ver uma breve explicação sobre como a difração de raio-x funciona elucidando a estrutura da molécula de DNA.

Figura 1: Reprodução parcial da figura original: http://home.sandiego.edu/~cloer/bio182s02/dna_xray.gif

Com base nos dados bioquímicos e cristalográficos então disponíveis, diversos modelos para o DNA foram propostos. Alguns autores imaginaram que a molécula fosse constituída por duas fitas polinucleotídicas com as bases voltadas para dentro, porém sem qualuqer relação específica entre elas. Outros imaginaram duas fitas com as bases voltadas para fora, ou ainda, três fitas entrelaçadas com as bases também voltadas para fora.

A descoberta de Watson e Crick

Em 1953, James Watson⁴ (n. 1928) e Francis Crick⁵ (n. 1916) apresentaram um modelo compatível com os resultados experimentais que haviam sido obtiodos até o momento. Esse modelo serviu de base para experimentos históricos que confirmaram sua hipótese inicial. A estratégia empregada por esses dois pesquisadores foi a construção de um modelo molecular que levava em conta o tamanho e configuração espacial dos nucleotídeos e ainda respeitava os dados de Chargaff e os dados obtidos pela difração de raios-X.

Segundo o modelo proposto por Watson e Crick, a molécula de DNA é constituída por duas cadeias polinucleotídicas dispostas em hélice ao redor de um eixo imaginário, girando para a direita (uma hélice dupla).

Figura 2: http://www.ocf.berkeley.edu/~bsj/images/dna.gif

As duas cadeias polinucleotídicas mantém-se unidas por pontes de hidrogênio, que se estabelecem entre pares de bases específicos: adenina com timina e citosina com guanina. Assim, as duas cadeias que constituem um segmento de DNA, são complementares entre si: onde em uma cadeia xistir uma timina, na outra existirá uma adenina, e onde em uma existir uma guanina, na outra existirá uma citosina.

Além disso, o modelo prediz que as duas cadeias polinucleotídicas sã antiparalelas, ou seja, elas tem polaridades opostas. As ligações fosfodiesterestão orientadas no sentido 3′ => 5′, ou seja, do carbono 3′ de um nucleotídeo ao carbono 5′ do nucleotídeo adjacente, enquanto que na fita complementar a orientação é inversa, do carbono 5′ ao 3′ (5′ => 3′).

Figura 4 - http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bookres.fcgi/mga/ch2f2.gif

Na figura 4, vemos um arranjo dos componentes do DNA. Um segmento da dupla hélice do DNA foi aberto aberto para mostrar as estruturas claramente:

(a) Um diagrama químico detalhado mostrando o esqueleto de açúcar-fosfato em azul e o hidrogênio ligando as bases no centro da molécula. Podemos ver o emparelhamento das bases (A-T, C-G).
(b) Uma versão simplificada do mesmo segmento, enfatizando o arranjo antiparalelo dos nucleotídeos, que está representado como as estruturas das figuras-L com o fosfato 5 na ponta do “L” e o 3 no vértice do “L”.

Os estudos de difração de raios-X haviam revelado que o diâmetro externo da dupla hélice é de cerca de 2 nm, enquanto que a distância entre os açúcares é de 1,1 nm. Assim, os pares de bases A-T e C-G têm o diâmetro exato para caber dentro da dupla hélice. Isso indicou que uma purina sempre se emparelha com uma pirimidina, porque o emparelhamento purina-purina ou pirimidina-pirimidina não tem diâmetros que se ajustem ao diâmetro interno da dupla hélice.

A hélice dá uma volta completa a cada 3,4 nm, que corresponde a cerca de 10 pares de bases. Assim, a distância entre dois pares de bases vizinhus é de 0,34 nm. As bases timina e adenina são emparelhadas por duas pontes de hidrogênio, enquanto que a guanina com a citosina são emparelhadas por três pontes de hidrogênio,como podemos ver na figura 3 acima.

Se pensarmos na hélice de DNA como uma estrutura cilindríca, com cerca de 2 nm de diâmetro, notaremos que a superfície da molécula é irregular, formando 2 sulcos ou depressões, de tamanhos diferentes, que giram ao longo de todo o seu comprimento. O sulco menor, resulta da depressão entre as duas cadeias complementares, enquanto que o sulco maior resulta da depressão existente entre os giros adjacentes da hélice. Os sulcos são importantes porque deixam livres superfícies para a interação entre o DNA e as proteínas.

Figura 5 - http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/books/bookres.fcgi/mga/ch2f3.gif

Imagem retirada de http://osulibrary.orst.edu/specialcollections/coll/pauling/dna/pictures/chargaff.jpg

Informações sobre Erwin Chargaff

Biografia resumida de Erwin Chargaff

Imagem retirada de http://www.nobel.se/medicine/laureates/1962/wilkins.gif

Biografia de Maurice Wilkins

Imagem retirada de http://www.accessexcellence.org/AB/BC/franklin.gif

Biografia:

http://www.accessexcellence.org/AB/BC/Rosalind_Franklin.html

http://www.sdsc.edu/ScienceWomen/franklin.html

http://www.pbs.org/wgbh/aso/databank/entries/bofran.html

Imagem retirada de http://www.cshl.org/public/SCIENCE/photos/watson.jpeg
Biografia:

http://www.cshl.org/public/SCIENCE/Watson.html

http://www.nobel.se/medicine/laureates/1962/watson-bio.html

http://www.mnsu.edu/emuseum/information/biography/uvwxyz/watson_james.html

Assita a uma entrevista de James Watson, clicando no link abaixo:

AVI – 2,3 MB
Vídeo retirado do site http://osulibrary.orst.edu/specialcollections/coll/pauling/dna/videos/dnastory02.avi, traduzido e legendado por Carla C. Alonzo Duclós.

http://www.nobel.se/medicine/laureates/1962/crick.gif

Biografia:

http://www.nobel.se/medicine/laureates/1962/crick-bio.html

http://www.pbs.org/wgbh/aso/databank/entries/bocric.html

http://www.salk.edu/faculty/faculty/details.php?id=14

Saiba mais sobre Crick:

http://www.accessexcellence.org/AE/AEC/CC/crick.html

Assita a um depoimento de Francis Crick, clicando no link abaixo:
AVI – 1,3 MB
Vídeo retirado do site http://osulibrary.orst.edu/specialcollections/coll/pauling/dna/videos/dnastory01.avi, traduzido e legendado por Carla C. Alonzo Duclós.

Em 1952, o trabalho de Alfred Hershey¹ (1908-1997) e Martha Chase² (1927-2003) veio contribuir com a identificação do DNA como material hereditário. Hershey e Chase realizaram um experimento que ficou conhecido como “blender experiment” (experimento do liquidificador) e que garantiu a Hershey o prêmio Nobel. O experimento foi um trabalho realizado com bactérias e o vírus bacteriófago T2.

virus bacteriófago T2: Organismo muito simples, constituído por uma molécula de DNA envolvida por uma cápsula protéica. O seu ciclo de vida era bem conhecido na época.

Um único vírus pode infectar uma bactéria e lisá-la em cerca de 30 minutos, liberando centenas de novos vírus que são cópias do fago iniciante. A dúvida na época era qual dos dois componentes do vírus, a cápsula de proteínas ou o DNA, constituiam o material hereditário.

Hershey e Chase basearam-se nas seguintes propriedades químicas das proteínas e do DNA:

proteínas: não contém fóforo em sua composição

DNA: não contém enxofre em sua composição

Os vírus utilizam matéria-prima da bactéria hospedeira para se reproduzir. Então, para realizar um experimento que pudesse evidenciar quem constituia o material hereditário do vírus, se era a proteína ou o DNA, eles marcaram, através das bactérias, as proteínas e o DNA dos vírus bacteriófagos, com isótopos radioativos.

Quando bactérias são cultivadas por algumas horas em um meio de cultura contendo um isótopo radioativo de um elemento, todas as moléculas das células bacterianas que possuirem esse elemento em sua composição, se tornarão moléculas radioativas. Se essas bactérias com células radioativas forem infectadas por vírus bacteriófagos, os novos vírus gerados (fagos), terão seu material radioativo também, pois os vírus utilizaram a matéria-prima bacteriana para se reproduzir.

Produzindo vírus marcados por radioatividade

marcando o DNA: Eles cultivaram bactérias em meio de cultura com fósforo radioativo, o que fez com que o DNA das bactérias ficasse radioativo. Então, infectaram essas bactérias com vírus, que se reproduziram e geraram novos vírus que passaram a ter o DNA radioativo.

marcando a cápsula protéica: Eles cultivaram bactérias em meio de cultura contendo enxofre radioativo. Assim, as bactérias produziram aminoácidos cisteína e metionina com o enxofre radioativo, e suas proteínas, consequentemente, ficaram radioativas Essas bactérias foram infectadas com vírus, que se reproduziram e geraram novos vírus que passaram a ter sua cápsula protéica radioativa.

Os dois tipos de vírus bacteriófagos radioativos foram utilizados para infectar, independentemente, bactérias normais (não-radioativas). O destino dos dois componentes, fósforo e enxofre, pode ser acompanhado devido a sua radioatividade.

Como o experimento foi feito:

As bactérias eram infectadas e imediatamente após, eram agitadas em um liquidificador, o que desfazia as ligações das capas protéicas virais adsorvidas às paredes das bactérias. Em seguida, eram centrifugadas a fim de separar as bactérias das capas protéicas virais. A radioatividade era medida nas bactérias e no sobrenadante da centrifugação, onde se encontravam as cápsulas virais.

Verificou-se que grande parte do fósforo radioativo que estava nos fagos infectantes, era transferida para o interior das bactérias infectadas e aparecia posteriormente nos novos fagos gerados com a lise das bactérias.

Já a radioatividade devida ao enxofre tinha um destino diverso, ela não penetrava na bactéria infectada e nem aparecia nos novos fagos.

Podemos ver, clicando no botão a seguir, o processo de infecção da bactéria pelo vírus bacteriófago T2. O DNA radioativo entra na bactéria, é replicado, sintetiza novas cápsulas virais e produz novos fagos que lisam a bactéria.

Esses resultados permitiram concluir que apenas o DNA do fago penetra na bactéria quando ocorre a infecção e que, a partir do DNA, é produzida toda uma geração de novos fagos com DNA e proteínas típicos da espécie de fagos utilizada. Portanto, podia-se concluir que a fonte das informações hereditárias é o DNA, pois a partir dele, pode-se produzir tanto DNA quanto proteínas virais.

http://www.cshl.edu/public/gifs/hershey.jpg

Biografias de Alfred Hershey:

http://www.cshl.edu/History/hershey.html

http://www.cshl.org/public/History/scientists/hershey.html

Informações sobre Alfred Hershey:

http://osulibrary.orst.edu/specialcollections/coll/pauling/dna/people/hershey.html

http://osulibrary.orst.edu/specialcollections/coll/pauling/dna/pictures/portrait-chase.jpg

Artigo sobre Martha Chase

Informações sobre Martha Chase

A descoberta da transformação bacteriana

A primeira evidência de que o DNA era o material hereditário foi obtida através de experimentos realizados com o pneumococo Streptococcus pneumoniae.

Os pneumococos podem se apresentar de duas formas:

1. Forma virulenta que causa a morte em camundongos por pneumonia: bactérias encapsuladas, que crescem em meio de cultura sólido e formam colônias convexas lisas, brilhantes, cremosas ecom bordos regulares, chamadas de colônias S (do inglês, smooth, liso).

2. Forma não virulenta, que não causa pneumonia em camundongos: Variante mutante, originada a partir da forma virulenta (S), mas que não apresentam cápsula e que crescem em meio sólido formando colônias achatadas, rugosas, opacas, friáveis e com bordos irregulares, chamadas de colônias R (do inglês, rough, rugoso).

A diferença entre os dois tipos de bactérias é a presença ou ausência da cápsula, que é composta de polissacarídeos. A variação na composição química dos polissacarídeos diferencia diversas linhagens de bactérias do tipo S, que chamamos de S-I, S-II, S-III, etc. As bactérias do tipo R, por não apresentarem cápsulas, não podem ser diferenciadas dessa maneira. No entanto, quando uma bactéria do tipo R, sofre mutação reversa, ela irá originar uma bactéria do tipo S, da mesma linhagem S que deu origem a ela.

linhagem S-I

R

linhagem S-I

Sobre a infecção de camundongos por essas bactérias, sabia-se que bactérias do tipo S (virulentas) mortas pelo calor, ao serem injetadas em camundongos, não lhes causavam pneumonia, assim como a injeção de bactérias R (não virulentas). Em 1928, o médico sanitarista Fred Griffith¹ (1877 1941), injetou em camundongos uma mistura de bactérias S mortas e bacterias R, e observou que os camundongos desenvolviam pneumonia. Além disso, foi observado também que células S apareciam vivas nos animais mortos e que essas células S eram do mesmo tipo que as células S mortas injetadas.

A seguir podemos ver um esquema do experimento de Griffith:

Deste fato, podia-se ter duas explicações:

1. As bactérias S mortas haviam ressucitado, o que seria um absurdo.

2. As bactérias R haviam sido transformadas em bactérias S por algum tipo de substãncia liberada pelas bactérias mortas.

Essa substância foi chamada de “princípio transformante” e essa transformação das bactérias R em S, foi chamada de transformação bacteriana.

O princípio transformante

O experimento original de Griffith foi repetido com sucesso em vários laboratórios.

No entanto, sua elucidação só aconteceu em 1944, após anos de estudos de Oswald Avery (1877 – 1955) e seus colaboradores. Eles descobriram que a transformação das bactérias ocorria também in vitro (em um meio de cultura, fora do corpo do camundongo), e que, em uma cultura com bactérias R e bactérias S (mortas pelo calor), apareciam células S vivas.

Em 1933, James Alloway (1900 – 1954) descobriu que um extrato de bactérias S, tinha a capacidade de transformar bactérias R em S. Descobriu também que se álcool fosse adicionado ao extrato, um precipitado espesso e viscoso se formava retendo a capacidade transformante. Acreditava-se até o momento que o poder transformante era das proteínas. A partir de então, tinham-se novas perspectivas para a purificação do “princípio transformante”.

Oswald Avery², Colin Macleod³ (1909 – 1972) e Maclyn McCarty⁴ (n.1911) isolaram, a partir de 75 litros de Streptococcus, 25 miligramas de um extrato com altíssimo poder transformante. Eles trataram esse extrato com diferentes substãncias:

- amilase (enzima que degrada polissacarídeos)

- protease (enzima que degrada proteínas)

- ribonuclease (enzima que degrada RNA)

- dnase (enzima que degrada DNA)

O único tratamento que fez o extrato perder completamente o seu “poder transformante” foi o tratamento com dnase.

Assim, em 1944, Avery e seu colaboradores, chegaram à conclusão de que a substância transformante era o DNA.

A partir de então, os pesquisadores começaram a levantar algumas hipóteses. Alguns achavam que se o DNA era capaz de transformar as características hereditárias das bactérias, então que ele mesmo era o próprio material hereditário. Outros, no entanto, acreditavam que mesmo após a purificação, poderiam restar quantidades mínimas de proteínas e que essas eram as responsáveis pela transformação. Por volta de 1952, conseguiu-se obter extratos que continham apenas 0,02% de proteínas, o que eliminava a possibilidade das proteínas serem as responsáveis pela transformação das bactérias.

Arquivo no formato PDF contendo informações sobre Fred Griffith. Clique no ícone abaixo para fazer o download ou visualizar o arquivo:

Arquivo: 90 Kb

Retirado de: http://profiles.nlm.nih.gov/CC/A/A/I/K/_/ccaaik.pdf

http://profiles.nlm.nih.gov/CC/A/A/L/P/_/ccaalp.jpg

Biografia de Oswald Avery

http://www.genomenewsnetwork.org/gnn_images/timeline/pictures/Macleod.jpg

Sobre o experimento de Avery, Macleod e McCarty

http://www.genomenewsnetwork.org/gnn_images/timeline/pictures/McCarty.jpg

A hipótese de que o DNA era a molécula que continha as instruções hereditárias foi levantada anos após a descoberta de sua existência no núcleo das células. Dois clássicos experimentos contribuiram para isso. O primeiro deles foi a identicação do material hereditário em bactérias, que levou à conclusão, em 1944, de que o princípio transformante das bactérias era o DNA. O outro experimento foi o da identificação do material hereditário de fagos, que, em 1952, revelou que apenas o DNA do fago penetrava e se multiplicava nas bactérias gerando novos fagos. Após a descoberta de que o DNA era o material hereditário, iniciou-se uma série de pesquisas que buscavam elucidar sua estrutura, e entender quais características permitiam ao DNA ser o banco de memória da informação hereditária.

Foram realizados experimentos que levaram a proposta do modelo da dupla hélice do DNA (1953), experimentos que evidenciaram a replição semiconservativa (1958) e um experimento que permitiu a visualição da replicação do cromossomo bacteriano (1960).

A descoberta do DNA ocorreu em 1869 e foi feita pelo bioquímico alemão Johann Friedrich Miescher¹ (1844 – 1895). Miescher buscava determinar os componentes químicos do núcleo celular e usava os glóbulos brancos contidos no pus para suas pesquisas. Os glóbulos brancos eram um bom material pois são células que apresentam núcleos grandes e fáceis de serem isolados do citoplasma. Além disso, o pús era muito fácil de se conseguir na época em ataduras usadas em ferimentos.

Analisando os núcleos, Miescher descobriu a presença de um composto de natureza ácida que era desconhecido até o momento. Esse composto era rico em fósforo e em nitrogênio, era desprovido de enxofre e resistente à ação da pepsina (enzima proteolítica). Esse composto, que aparentemente era constituído de moléculas grandes, foi denominado, por Miescher, nucleína. Essa substância foi isolada também da cicatrícula da gema do ovo de galinha e de espermatozóides de salmão.

Em 1880, um outro pesquisador alemão, Albrecht Kossel² (1883 – 1927), demonstrou que a nucleína continha bases nitrogenadas em sua estrutura, explicando o fato da nucleína ser rica em nitrogênio. Nove anos depois, Richard Altmann³ (1852 – 1900), que era aluno de Miescher, obteve a nucleína com alto grau de pureza, comprovando sua natureza ácida e dando-lhe, então, o nome de ácido nucléico.

A partir daí, o material mais utilizado para estudo e obtenção do ácido nucléico passou a ser o timo de bezerro, cujo tecido apresenta células com núcleos grandes. Foi descoberto que a degradação do ácido nucléico do timo, chamado de ácido timonucléico, liberava quatro tipos de bases nitrogenadas:
- dois tipos de bases púricas: adenina e guanina

- dois tipos de bases pirimídicas: citosina e timina

Foi demonstrado também que um outro produto da degradação do ácido nucléico era um glicídio com 5 átomos de carbono, uma pentose, no caso uma desoxirribose. O fósforo estava presente na forma de um derivado do ácido fosfórico, fosfato. Tinha-se até o momento que o ácido nucléico era composto de bases nitrogenadas (púricas e pirimídicas), de um glicídio (pentose) e de fosfato.

Em 1890, foi descoberto em levedura (fermento) um outro tipo de ácido nucléico, que possuía uracila ao invés de timina e ribose ao invés da desoxirribose. Dessa maneira, foram caracterizados dois tipos de ácidos nucléicos, de acordo com o glicídio que possuíam:

- ácido ribonucléico (RNA)
- ácido desoxirribonucléico (DNA)

Em 1912, Phoebus Levine⁴ (1869 – 1940) e Walter Jacobs (1883 – 1967) concluíram que o componente básico dos ácidos nucléicos era uma estrutura composta por uma unidade que se constituía numa base nitrogenada ligada a uma pentose, e esta por sua vez, ligada a um fosfato. Esta unidade foi denominada de nucleotídeo.

Um ácido nucléico seria então uma molécula composta por vários nucleotídeos unidos entre si, ou seja, um polinucleotídeo.

Os estudos dos ácidos nucléicos continuaram por muitos anos sem que os cientistas soubessem de sua importância como material hereditário, descoberta que só foi realizada muitos anos depois.

(Imagem retirada de: http://www.fml.tuebingen.mpg.de/miesch2.gif)

– Biografia de Johann Friedrich Miescher

http://www.nobel.se/medicine/laureates/1910/kossel-bio.html

Biografia de Albrecht Kossel

Biografia de Richard Altmann

Informações sobre Phoebus Levine – Enciclopédia Britânica